La conoscenza della quantità di sostanze grasse all’interno di una pelle da destinare alla produzione di cuoio è importante sia per prevedere e gestire l’efficacia dei vari prodotti chimici aggiunti durante il processo di concia, sia per minimizzare la possibilità di avere difetti sul prodotto finito, quali ad esempio efflorescenze grasse o macchie dovute a precipitati di saponi di grasso.
La composizione della fase grassa può variare da specie a specie oltre che dipende dalla provenienza dell’animale, potendone in alcuni casi divenire una caratteristica peculiare e distintiva, anche considerando quella residua riscontrabile in un cuoio semilavorato e, in opportune condizioni, anche finito.
Una componente fondamentale delle sostanze grasse presenti all’interno della pelle è normalmente rappresentata da trigliceridi.
Struttura di un trigliceride
Un trigliceride è composto da una molecola di glicerina alla quale sono legate tre catene di acidi grassi, che possono essere anche diversi tra loro e la cui lunghezza ed il cui numero di doppi legami presenti ne determina variazioni nel comportamento chimico. Una maggiore lunghezza ne determina un maggior carattere apolare e punti di fusione iù elevati, così come un maggior numero di insaturazioni li rende più polari oltre che con una maggiore presenza di punti di attacco da parte di agenti esterni che ne possono provocare l’ossidazione o altri tipi di decomposizioni.
Strutture di alcuni acidi grassi con differenti lunghezze di catena carboniosa e numero di insaturazioni
Reazioni di idrolisi del legame che lega la parte glicerica e la parte di acido grasso fanno sì che, tra le sostanze grasse, siano inevitabilmente presenti anche acidi grassi liberi.
È proprio la composizione percentuale totale degli acidi grassi presenti in tutti i trigliceridi e negli acidi grassi liberi ad essere la caratteristica peculiare di una fase grassa saponificabile.
L’analisi delle sostanze grasse in un cuoio e la successiva determinazione della composizione degli acidi grassi, prevede una prima fase di estrazione con un solvente o miscela di solventi apolari nei quali vengono estratti gli acidi grassi liberi, le sostanze grasse insaponificabili e le sostanze grasse saponificabili.
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Normalmente l’estrazione avviene utilizzando esano con un rapporto di estrazione di 1 parte di cuoio e 20 parti di solvente. Tale estrazione può essere condotta in un bagno ad ultrasuoni alla temperatura di 50°C per 60 minuti in contenitore a tenuta stagna a pareti spesse. Questo tipo di estrazione ha il vantaggio di poter lavorare con piccole quantità di solventi e di essere scalabile a piccole quantità di campione disponibile. |
Estrazione di cuoio con esano |
Al termine dell’estrazione, raffreddato il tutto, il solvente viene filtrato per separare i residui solidi e concentrato mediante blando riscaldamento sottovuoto con un evaporatore rotante. I trigliceridi contenuti nella fase organica apolare vengono sottoposti alla reazione di transesterificazione che ha lo scopo di liberare gli acidi grassi costituenti e convertirli in esteri metilici per renderli più apolari rispetto alla forma acida, facilitandone così la successiva separazione e caratterizzazione.
La transesterificazione è, quindi, la conversione da esteri glicerici di acidi grassi a esteri ottenuti con un altro alcol, normalmente il metanolo.
Schema della reazione di transesterificazione
La reazione di transesterificazione può essere condotta o mediante utilizzo di basi, normalmente metanolo in ambiente basico per KOH o direttamente con metilato di sodio, oppure in ambiente acido, utilizzando metanolo ed acido solforico.
Lo svantaggio dell’ambiente basico è la eventuale reazione di saponificazione di parte degli acidi grassi ottenuti che potrebbe portare alla formazione di emulsioni e rendere difficile la successiva fase di separazione e purificazione degli esteri prodotti.
Operando, invece, con metanolo in ambiente acido si ottiene, oltre alla transesterificazione dei trigliceridi, anche la trasformazione in esteri degli acidi grassi liberi.
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Reazione di transesterificazione in atto; i trigliceridi, che sono ancora solo parzialmente decomposti, creano microemulsioni in entrambe le fasi.
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Reazione terminata. Il glicerolo è solubilitzzato nella parte idroalcolica mente gli esteri e gli insaponificabili sono nella fase organica. L’aggiunta di sali nella fase acquosa favorisce la rottura delle eventuali emulsioni.
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A fine reazione la fase organica viene dibattuta diverse volte con acqua per eliminare ulteriori residui di sostanze idrosolubili per poi essere essiccata, dopo separazione dalla fase acquosa, per passaggio su sodio solfato anidro.
La tecnica di elezione per la successiva determinazione degli esteri ottenuti da sostanze grasse è la tecnica gascromatografica, che separa i componenti della miscela in base alla loro temperatura di ebollizione ed alla loro diversa affinità per un supporto attraverso il quale viaggiano e con il quale interagiscono. Essa è tradizionalmente associata alla rivelazione mediante ionizzazione di fiamma, FID, che sfrutta, ai fini della rilevazione, la combustione dei composti che mano escono dalla colonna capillare contenente il supporto atto a separare i composti. Tale tipologia di rilevazione, però, dà solo alcune indicazioni orientative sulle caratteristiche dei diversi composti che man mano fuoriescono dalla colonna di separazione e bruciano per dare il segnale, in tempi che possono dipendere dalla dimensione e polarità delle molecole, a parità di altre condizioni sperimentali. L’unico modo di identificarlisarebbe attraverso il confronto con il tempo di uscita di un composto noto, analizzato nelle stesse condizioni cromatografiche. Questa limitazione diventa rilevante e onerosa nel caso di miscele con un numero elevato di composti, inaspettati oltre che incogniti.
Una tecnica di rilevazione alternativa che dà maggiori informazioni sui composti in esame è la rilevazione a filtro di massa che, mediante l’analisi dei frammenti molecolari ottenuti per l’impatto di elettroni sul composto in uscita dalla colonna, permette di risalire con ottima confidenza alla struttura del composto, anche mediante confronto con librerie di frammentazioni chimiche.
Separazione cromatografica di esteri metilici di acidi grassi su colonna polare SGE BP20.
Frammentazione rilevata per il picco con tempo di ritenzione di 40.19 minuti.
Identificazione del picco eluito a 40.19 minuti per confronto con libreria spettrale NIST
Quelli riportati nella tabella seguente sono i risultati ottenuti dalla procedura analitica appena descritta applicata ad un campione di cuoio ottenuto da pelle di coccodrillo. Il campione in esame ha mostrato la presenza, in concentrazioni molto più elevate rispetto ad altre specie animali, di acidi grassi insaturi e poli-insaturi a catena medio-lunga. Questa peculiare caratteristica della composizione del grasso di coccodrillo, riscontrabile anche in diverse altre fonti di letteratura scientifica, ne determina un uso diffuso in campo nutrizionale e medico.
Composizione degli esteri metilici degli acidi grassi ottenuti da sostanza grassa estratta da cuoio di coccodrillo
L’utilizzo della rivelazione post GC con filtro di massa ed il confronto con librerie spettrali ha permesso una identificazione relativamente agevole e con discreta certezza di tali composti anche senza l’iniezione di sostanze pure da utilizzare come riferimento, come sarebbe stato necessario fare nel caso di utilizzo di rilevazione FID, sebbene tale pratica non avrebbe assicurato una identificazione univoca a causa della possibilità di co-eluizione di composti con caratteristiche simili.
A cura del Dr. Leopoldo Esposito – Resp. Laboratori SSIP
20-09-2024